Dialogue sur la PCR
10
mar.
2007
Le dialogue est une forme canonique et historique de la vulgarisation des sciences, essentiellement depuis le Dialogue sur les deux grands systèmes du monde de Galilée. J'ai l'honneur de présenter ici le premier billet à quatre mains du C@fé des sciences, sous la forme d'un dialogue entre un apprenti-biologiste (Benjamin) et un apprenti-sociologue (moi-même). Espérons que d'autres suivront…
©© Epicatt
Enro : Benjamin, si tu es comme les quelques thésards en biologie que je connais, tu dois gonfler tes proches en les bassinant régulièrement avec ta « PCR qui n'a pas marché » ou tes « amorces de m**** ». Je me trompe ?
Benjamin : Non, c'est vrai… j'en fais tous les jours avec des fortunes diverses.
Enro : La PCR, ou Polymerase Chain Reaction (« réaction en chaîne par polymérase »), est un peu une photocopieuse à ADN. Corrige-moi si je me trompe mais tu mets ton échantillon dans la machine, contenant quelques exemplaires d'un brin d'ADN qui t'intéresse, et hop, avec les bonnes « amorces » elle va enchaîner les cycles de duplication des brins d'ADN et séparation des doubles brins obtenus. A chaque cycle la quantité est multipliée par deux et les quelques exemplaires deviennent des milliers d'exemplaires après, quoi… une heure ? Deux heures ?
Benjamin : Les mots de Mullis, inventeur de la PCR, sont : « Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon. The reaction is easy to execute. It requires no more than a test tube, a few simple reagents, and a source of heat. »
Enro : Ah, des milliards de copies, donc. J'étais loin du compte !
Benjamin : Quant à la durée… Nos réactions de PCR comportent 30 cycles (la norme est de 25 à 30), ce qui devrait donner 2^30=1 milliard de copies de chaque exemplaire introduit. Evidemment, l'efficacité des amorces, de l'enzyme et la limitation par la quantité d'amorces et de nucléotides font que la « courbe de croissance » s'aplatit bien avant.
Enro : Bon, combien de cycles et combien de temps en tout alors ?
Benjamin : Un cycle se décompose en plusieurs phases :
- 94°C dénaturation initiale des deux brins
- 55°C hybridation des amorces à la matrice (ADN simple brin)
- 72°C élongation par la Taq polymérase (nom de l'enzyme dérivé de la bactérie Thermus aquaticus)
- 94°C dénaturation à nouveau
- retour à 55°C…
Enro : Et dire qu'avant tout se faisait à la main… Les biologistes trempaient leurs bassines dans les différents bacs, successivement… On comprend pourquoi Mullis a eu le Prix Nobel, grâce a lui les labos ont économisé pas mal de main d'œuvre ! J'ose pas imaginer l'état de la recherche française sinon !
Benjamin : C'est plutôt l'inventeur du thermocycleur qui aurait dû avoir le Nobel alors :-)
Enro : Pffff… C'était petit, ça !! Mais tu as raison, l'invention de la PCR n'est pas uniquement celle du thermocycleur… Au début, Kary Mullis travaillait sur la synthèse d'oligonucléotides, c'est-à -dire de petits brins d'ADN ou ARN, dans l'entreprise de biotechnologie Cetus. Mais après avoir automatisé ces synthèses laborieuses, voilà que son équipe disposait de plein de temps libre !
Benjamin : Encore une histoire de temps libre !
Enro : Eh oui. Et à force de réflexion, alors qu'il conduit entre San Francisco et Mendecino en avril 1983, il a l'idée géniale de combiner deux choses : les mécanismes de dénaturation/re-naturation de l'ADN, et le concept de boucle itérative. Mais pour lui, l'idée était trop évidente pour que quelqu'un n'y ait pas déjà pensé. Une recherche bibliographique lui montrera que tel n'est pas le cas et le voici lancé, malgré le peu de soutien de ses collègues, jusqu'à réussir la première PCR en décembre 1983. L'histoire veut que seul Halluin, le chef des brevets, était encore présent au bureau ce soir là , et Mullis de traverser le hall pour partager sa joie. Halluin se met à rédiger une demande de brevet immédiatement, et celle-ci sera déposée malgré le peu d'enthousiasme (au début au moins) de l'équipe et du PDG. Pour l'anecdote quand même, l'article de Mullis qui explique le principe de la PCR, celui qui lui vaudra finalement le Prix Nobel, sera rejeté successivement par les revues Nature et Science, et seulement accepté par la modeste Methods of Enzymology !! De quoi remonter le moral de tous les thésards qui ne publient pas dans Nature ou Science, n'est-ce pas ?
Benjamin : (tête de thésard renfrogné) Mgnmgngrmbl Laisse-moi plutôt te parler des applications à la PCR. J'en vois quatre, chacune exploitant une de ses particularités :
- la copie fidèle permet le séquençage
- l'amplification quantitative permet la préparation de fragments d'intérêt
- l'incorporation des amorces permet l'introduction de mutations
- la spécificité des amorces permet le diagnostic.
Commençons par l'application la plus triviale, le séquençage : j'envoie assez souvent de l'ADN à un laboratoire spécialisé, accompagné de l'amorce qui marque le début de la région dont je souhaite avoir la séquence. Il s'agit ensuite de réaliser une PCR classique, mais où une fraction des nucléotides arrêtent l'élongation du brin amplifié. Ils sont de plus marqués par une molécule fluorescente. Chaque fragment amplifié d'une longueur donnée finit donc par le même nucléotide (puisqu'ils ont le même point de départ et un sens de polymérisation imposé par l'amorce), que l'on a les moyens de connaître : le fragment de 50 nucléotides fluoresce en vert, il finit donc par un A ; 51 nucléotides, en bleu, c'est donc un G, etc.
En biologie moléculaire, on aime bien connaître la fonction du gène auquel on s'intéresse. Pour cela, on a souvent besoin de constructions d'ADN un peu compliquées (on coupe ici, on colle là …), en général réalisées par des enzymes. La première utilité de la PCR est donc de fournir les quantités d'ADN nécessaires à ces constructions. On peut également utiliser la PCR pour réaliser certaines de ces opérations de « collage » entre fragments… pourquoi rigoles-tu ?
Enro : J'imagine comment tout serait plus simple si la taille de l'ADN était de l'ordre du centimère… On pourrait utiliser de la vraie colle et des vrais ciseaux pour faire ce bricolage. De l'ordre du mètre, par contre, on risquerait d'avoir des problèmes d'encombrement dans les laboratoires de génétique !
Benjamin : Tiens, tu me rappelles Shrà¶dinger : dans Qu'est-ce que la vie ?, il disserte longuement sur « pourquoi les atomes sont-ils si petits ? » Il conclut que le désordre à l'échelle des atomes nous impose d'être grands (sinon il n'y aurait pas d'ordre stable face à l'agitation thermique, donc pas de vie) et insensible au mouvement incessant des atomes, sans quoi nous deviendrions fous ! Heureusement, la PCR est là pour nous aider à accéder à une information logée dans quelques atomes, et mieux, à la changer ! J'en viens donc à ma troisième application : une PCR amplifie un fragment situé entre deux amorces spécifiques et elle marche d'autant mieux que ces amorces ont de nombreux nucléotides communs avec l'ADN qui sert de modèle. Idéalement, les amorces doivent donc être la copie conforme de la séquence patron, mais elles tolèrent facilement un ou deux petits changements… On peut donc introduire volontairement une mutation ponctuelle dans l'amorce (il suffit de la commander telle au fournisseur du labo), et comme l'amplification de chaque fragment incorpore deux amorces, on obtient après la PCR de très nombreuses copies de l'ADN mutées là où on l'a décidé ! On peut utiliser ce produit de « mutagénèse dirigée » pour remplacer le gène naturel, créer des protéines différentes, introduire des sites de restriction…
Enfin, grâce à la spécificité des amorces, on peut :
- soit vérifier la longueur du fragment amplifié entre les deux amorces, si par exemple on y a introduit quelque chose
- soit vérifier la présence dans l'ADN testé d'une séquence identique à celle d'une amorce utilisée. Ainsi, si je connais un gène propre à un microbe pathogène, je choisirai deux amorces situées dans ce gène pour en révéler la présence.
Enro : C'est précisément cette dernière technique qui a été utilisée dans l'article de Quist et Chapela de 2001 rapportant la présence — dans des variétés sauvages de maïs mexicain — du promoteur 35S d'un virus du chou-fleur couramment utilisé dans les OGM. Première preuve de « pollution génétique » qui, tu le sais sans doute, a été très controversée et sur lequel il est intéressant de s'arrêter un peu. En effet, les auteurs avaient utilisé deux techniques de PCR pour détecter ce transgène et comprendre si son insertion s'était produite à une ou plusieurs reprises. Cette technique qui présentait pour eux l'avantage d'être « très sensible » (cf. le communiqué de presse de l'UC Berkeley), utile lorsqu'on a que quelques échantillons, a été critiquée rapidement par leurs adversaires. Ainsi, P. Christou signait au nom du comité éditorial de la revue Transgenic Research (vol. 11, février 2002, pp. 3-5) une tribune virulente où il qualifie la PCR de technique « discutable » et « propice aux artefacts ». La PCR serait même si peu fiable qu'elle invaliderait par avance tout résultat qui s'appuierait dessus ! Ce qu'il n'aurait sans doute pas osé dire en dehors d'une controverse comme celle-ci. C'est là qu'intervient la notion de « boîte noire », chère à la sociologie des sciences : ici, une méthode utilisée en routine et que l'on n'interroge plus, une boîte noire à qui on confie ses résultats, est soudain réouverte et réinterrogée à la faveur d'une controverse. Ces retours sur ce qui était acquis sont parfois salutaires, parfois du temps perdu, mais montrent que la science avance nécessairement en acceptant de plus en plus de choses. On ne peut, à chaque PCR ou manipulation, requestionner l'échelle des températures, le dogme central de la biologie, les lois de l'électricité, la structure de l'ADN etc.
Benjamin : Oui, et heureusement ! J'aimerais toutefois apporter une petite nuance : la PCR n'apporte qu'une information partielle, et qui peut être biaisée par de nombreux facteurs. J'en ai moi-même pâti récemment, car rien ne vaut un bon séquençage.
Enro : La PCR a aussi d'autres aspects qui la rendent intéressante pour la sociologie des sciences. On peut par exemple rappeler l'affaire du maïs Starlink : lors de celle-ci, les Américains ont retrouvé dans leurs chips de maïs des OGM qui n'auraient pas dû s'y trouver. Alors, la PCR a été mobilisée comme « un allié précieux du mouvement anti-OGM puisqu'elle permet de rendre sensible la présence des OGM et de les traquer dans les produits les plus courants » (Joly et al., 2001, p. 65). Où un simple outil de biologie moléculaire peut devenir un instrument (voire un acteur) politique ! Et peut-être est-ce parce que les chercheurs pro-OGM ont été ainsi dépossédés de cet outil qu'ils n'ont pas hésité à le remettre en question lors de la controverse sur la maïs mexicain…
Commentaires
Super billet ! J'aime beaucoup le passage sur l'invention de la PCR et sur le papier rejeté (effectivement, c'est très réconfortant surtout quand on vient de se faire jeter un papier important comme moi :P) Sinon, une petite question : naif, j'ai toujours cru que le séquençage commençait par une PCR... Comment donc accède-t-on à l'information génétique dans ce cas ?
Excellent dialogue... Pensez vous qu'on pourra un jour se passer de PCR, et par exemple, utiliser un synthétiseur d'ADN? Ca pourrait éventuellement réduire les erreurs de séquence, et contrôler précisement le nombre de copies d'ADN dans le résultat. Je ne connais pas l'état de l'art dans le domaine des synthétiseurs d'ADN, je vais me renseigner... Peut etre que ce jour la, nos chefs de labo arreteront de nous parler de l'époque héroique ou ils faisaient les PCR avec des bassines!
Je voudrais apporter quelques modifications a la presentation que vous faites de l’invention de la PCR. Le principe de la PCR n’etait pas complique au point que personne n’y ait pense avant Kary Mullis. Khorana (prix Nobel en 1968) est cite pour en avoir trouve le principe en 1969 avec un autre chercheur http://en.wikipedia.org/wiki/Nobel_Prize_controversies .
Kary Mullis n’a vraisemblablement pas eu connaissance de cette anteriorite et en a retrouve independamment le principe. Mais tout le credit doit lui etre accorde pour avoir montre que ce principe etait appliquable, ce qui etait difficilement imaginable au debut des annees 80, sauf pour quelqu’un travaillant, comme c’etait son cas, sur la synthese d’oligonucleotides.
Replacons nous dans le contexte de l’epoque : au debut des annees 80, on sait cloner un gene en l’inserant dans un plasmide vecteur qui se multiplie dans une bacterie. Ca prend du temps mais c’est la bacterie qui fait le travail. Lorsque Mullis montre que la technique marche, il a du mal a publier. Normal : pour pouvoir faire une PCR il faut connaitre la sequence (ce qui n’est pas necessaire avec les vecteurs) ; or tres peu de sequences de genes sont connues a l’epoque ; il faut synthetiser des oligonucleotides et tres peu de labos savent faire ca. Il faut, meme avec une polymerase thermostable (dans le cas inverse c’est encore pire, il faut rajouter de l’enzyme a chaque cycle) changer les tubes de bac a chaque cycle. Pas de quoi crier de joie dans les labos.
La force de Mullis et de Cetus a ete de developper le projet (avec notamment la creation du thermocycleur) de maniere a en faire une technique simple d’utilisation. L’augmentation exponentielle du nombre de sequences nucleiques disponibles a achever de faire de la PCR un outil de base des laboratoires.
Finalement, la question est
. A celui qui en a eu l'idée, ou a celui qui fait qu'elle devient applicable sans trop de problèmes?je trouve votre dialogue super bien, j'ai préparé moi aussi 1 exposé sur la PCR , voila 1 résumé:
I- Introduction :
La « Polymerase Chain Reaction » ou PCR (ou encore ACP pour Amplification en Chaîne par Polymérase), est une technique de réplication ciblée in vitro. Elle permet d’obtenir, à partir d’un échantillon complexe et peu abondant, d’importantes quantités d’un fragment d’ADN spécifique et de longueur définie. L’ordre de grandeur à retenir est celui du million de copies en quelques heures. Le principe et les conditions expérimentales qui en découlent sont très simples. Il s’agit de réaliser une succession de réactions de réplications d’une matrice double brin d’ADN. Chaque réaction met en œuvre deux amorces oligonucléotidique dont les extrémités 3-prime pointent l’une vers l’autre. Les amorces ou « primers » en anglais définissent alors la séquence à amplifier. L’astuce consiste à utiliser les produits de chaque étape de synthèse comme matrices pour les étapes suivantes, au lieu de les séparer afin de ne réutiliser que la matrice originale. Au lieu d’être linéaire, l’amplification obtenue est exponentielle. La PCR est rapidement devenue l’une des techniques les plus largement répandues dans la biologie moléculaire et pour la bonne raison : c’est des moyens rapides, peu coûteux et simples de produire relativement au grand nombre de copies des molécules d’ADN à partir des quantités minutieuses de matériel d’ADN de source, même lorsque l’ADN de source est de qualité relativement inférieure. La PCR comporte la préparation de l’échantillon, du mélange principal et des amorces, suivies de détection et d’analyse des produites de réaction. Le taux de multiplication (ou taux d’amplification) est tel que la réaction revient à rendre négligeable le reste du génome qui n’a pas été amplifié car le produit de PCR contient presque exclusivement des millions d’exemplaires de la séquence cible. Il est donc facilement analysable par exemples sur un gel d’électrophorèse en fluorescence UV sans avoir à rechercher spécifiquement la séquence cible par hybridation moléculaire comme c’était le cas auparavant (technique de Southern). La PCR est utilisée dans la très vaste majorité des diagnostics moléculaires. Imaginée par K. Mullis en 1985 (Pris Nobel dès 1993), la technique connaît un essor considérable à partir de la commercialisation (vers 1988), d’une ADN polymérase résistante aux températures élevées (Taq polymérase), qui permet une automatisation de la technique. La technique a révolutionné beaucoup d’aspects de recherches courante, y compris le diagnostic des défauts génétiques et la détection du virus de SIDA en quelques humains. Cette technique est également employée par des criminologistes pour lier les personnes spécifiques aux échantillons sang ou cheveux par l’intermédiaire de comparaison d’ADN. La PCR a également affecté des études évolutionnaires parce que les grandes quantités d’ADN peuvent être manufacturées des fossiles contenant des traces.
II- Aspects généraux de PCR :
1/ Préparation du témoin :
La PCR est très souple, beaucoup de types d’échantillons peuvent être analysés en acides nucléiques. La plupart des PCR emploie l’ADN comme cible, plutôt que l’ARN, en raison de la stabilité de la molécule d’ADN et de la facilité avec lesquelles l’ADN peut être isolé. Par après quelques règles de base, des problèmes peuvent être évités dans la préparation de l’ADN pour la PCR. Les critères essentiels pour n’importe quel échantillon d’ADN sont qu’ils contiennent au moins une rive intacte d’ADN entourant la région à amplifier et que toutes les impuretés sont suffisamment diluées pour ne pas empêcher l’étape de polymérisation de la réaction de PCR.
2/ Amorces :
Une amorce est un segment court des nucléotides qui est complémentaire à une section d’ADN qui doit être amplifiée dans la réaction de PCR. Des amorces sont recuites au calibre dénaturé d’ADN pour fournir un emplacement de déclenchement pour l’élongation de la nouvelle molécule d’ADN. Les amorces peuvent ou être spécifiques à un ordre particulier de nucléotide d’ADN ou elles peuvent être « universel ». Les amorces universelles sont complémentaires aux ordres de nucléotide qui sont très communs dans un ensemble particulier de molécules d’ADN. Ainsi, elles peuvent lier à une grande variété de calibres d’ADN. Les gènes ribosomal bactériens d’ADN contiennent les ordres de nucléotide qui sont communs à toutes les bactéries. Ainsi, des amorces universelles bactériennes peuvent être faites en créant les amorces qui sont complémentaire à ces ordres.
3/ Détection et analyse du produit de réaction :
Le produit de PCR devrait être un fragment ou des fragments d’ ADN de la longueur définie. La manière la plus simple de vérifier la présence de ces fragments est de charger un échantillon prélevé du produit de réaction, avec les marqueurs appropriés de poids moléculaire, sur un gel d’agarose qui contient 0.8-4.0 % bromures d’éthidium. Des bandes d’ADN sur le gel peuvent alors être visualisées sous le transport-illumination ultra-violette. En comparant, le produit se réunit avec des bandes des marqueurs connus de poids moléculaire.
III- Le milieu réactionnel :
Le milieu réactionnel doit contenir :
- L’ADN contenant la séquence à amplifier ; il peut s’agir de l’ADN génomique d’un patient pour lequel on cherche à réaliser le diagnostic moléculaire d’une maladies génétique, d’ADN plasmidique contenant une séquence d’intérêt etc….
- Les deux amorces oligonucléotidiques monobrins complémentaires chacune d’une des extrémités du fragment à amplifier.
- Des désoxynucléotides libres dATP, dCTP, dGTP, dTTP qui sont incorporables pour former le brin d’ADN néosynthétisé.
- L’enzyme permettant la synthèse d’un néobrin à partir des amorces ; il s’agit d’une ADN polymérase thermostable, par exemple la Taq DNA polymerase issue du micro-organisme Thermus Aquaticus.
- Du MgCl2 et une solution donnant au milieu réactionnel un PH et une concentration saline optimale pour le fonctionnement de l’enzyme.
Le tube contenant le milieu réactionnel est placé dans un appareil appelé « thermocycleur », sorte de plaque chauffante programmable en temps et en température et disposant de délais de montée et de descente en température extrêmement courts. Il délivre à chaque instant au milieu réactionnel une température donnée permettant la réalisation de l’une des trois étapes du cycle de PCR : dénaturation, hybridation ou synthèse et élongation.IV- Les limites de la technique :
V- Principe :
La PCR est une technique basée sur une répétition de cycles de transition de température. Sauf pour certaines méthodologies (par exemple l’utilisation de sondes d’hydrolyse), chaque cycle contient trois étapes détaillées ci-dessous. Considérant dans l’exemple avoir une efficacité de PCR de 100%.
Evolution de la température et des différents types de brins d'ADN au cours des 4 premiers cycles de la PCR
1/ Les différentes étapes de la PCR :
2/ Evolution de l'ADN au cours des 4 premiers cycles :
Cycle #1 :
b) Cycle #2 :
Les trois phases se déroulent de la même manière qu’au cycle #1, sauf que deux polymérases arrivées au bout de leur ADN matrice se décrochent spontanément. A la fin de la phase 3, nous obtenons tout les types d’ADN qui existeront lors de la PCR, soit :
c) Cycle #3 :
Identique au cycle 2. A la fin de la phase 3, nous observons 1 brin de type A et F, 3 de B et D, et 4 de C et E. Nous observons l’apparition de deux molécules d’ADN double brins C-E qui correspond à notre amplicon.
d) Cycle #4 :
Identique au cycle 2. A la fin de la phase 3, nous observons 1 brins de type A et F, 4 de B et D, et 11 de C et E. Nous observons que l’amplicon devient la combinaison majoritaire. Avant que le produit de PCR soit employé dans d’autres applications, il doit vérifier si :
VI- La PCR en bactériologie :
La PCR présente un certain nombre d’avantages … et un certain nombre d’inconvénients par rapport aux techniques classiques (et de référence), utilisées dans la recherche et l’identification des bactéries. Que ce soit en milieu hospitalier, en écologie des sols, en archéologie etc... Il ne s’agit pas de « vouloir » absolument utiliser la PCR, ni même remplacer les techniques traditionnelles. Il s’agit simplement d’effectuer quelques comparaisons très théoriques afin d’expliquer pourquoi, dans certains cas la PCR peut compléter très efficacement les techniques classiques. L’un des buts de la microbiologie est l’identification et la classification des microorganismes en groupes d’affinités (taxons), afin de mieux appréhender leur extraordinaire diversité. L’approche diagnostique concerne la détection d’un germe connu dans un prélèvement éventuellement polymicrobien ( produit pathologique tel que des selles ou un pus ). L’approche taxonomique concerne l’identification et la classification de microorganismes, éventuellement inconnus. Les deux approches utilisent des techniques de « recherche » des microorganismes.
Les techniques d’identification ainsi que les critères de classification mis à la disposition des microbiologistes évoluent sans cesse. Le développement des techniques de biologie moléculaire a, en particulier, introduit de nouveaux critères d’identification basée sur l’étude de la présence de certains gènes, sur l’étude de leur séquence etc. ... L’extrême variété des génomes a permi la différenciation de germes jusqu’alors confondus, de définir des gènes ou des séquences d’ADN spécifiques (facteurs de virulences particuliers, résistance à une famille d’antibiotique etc…). L’application des méthodes de biologie moléculaire au diagnostic classique se heurte principalement à un problème de sensibilité : les acides nucléiques bactériens sont souvent présents en trop faibles quantités. Les techniques d’amplification telle que la PCR peuvent parfois permettre de contourner ce problème de sensibilité.
1/ Quelques raisons :
Les techniques dite traditionnelles d’identification :
Sans entrer dans les détails, pour identifier une bactérie dans un prélèvement il faut : d’abord l’obtenir en culture pure (l’isoler des autres germes éventuellement présents dans le prélèvement) puis déterminer certains de ses caractères morphologiques, biochimiques, antigéniques et culturaux.
Les techniques traditionnelles d’identification des bactéries souffrent de certaines limitations :
La PCR dans le diagnostic bactériologique :
La technique de PCR est a priori ;
L’identification finale :
Elle consiste à donner la position taxonomique de la bactérie. Mais, en pratique, ce n’est pas l’information la plus intéressante. Un médecin s’intéressera plus particulièrement au potentiel pathogène d’une bactérie (expression de facteurs de virulences, résistance à des antibiotiques). Ces informations, leur fiabilité ainsi que le délai nécessaire pour les obtenir sont aussi des critères importants pour évaluer.
Echantillon à analyser
Mise en culture et isolement
PCR
Culture pure
Identification
Comparaison des méthodes classiques d’identification des bactéries avec une approche par PCR. Les techniques traditionnelles d’identification des bactéries servent encore, la plupart du temps, de techniques de référence. Dans certains cas elles sont avantageusement remplacées et/ou complétées par la PCR.
2/ La PCR inverse ou Reverse Transcriptase PCR :
L’acronyme RT-PCR signifie Reverse Transcriptase PCR, soit une PCR après transcription inverse d’un acide ribonucléique (ARN) en ADN complémentaire ADNc). C’est une technique très utilisée en bactériologie et en virologie. En réalité, il s’agit d’une PCR « classique » réalisée sur un ADN complémentaire (ou ADNc), qui est une copie d’un ARN obtenue par transcription inverse. La RT-PCR a été mise au point pour utiliser les ARN comme matrice d’amplification de la PCR. Elle est certainement la méthode la plus sensible pour détecter (et éventuellement quantifier), les ARN messagers au niveau d’un organe, d’un tissu ou d’une cellule entre autres une bactérie. Dans ce but elle est souvent réalisée in situ, c'est-à -dire sur du matériel biologique fixé. Elle est également utilisée pour la construction de banques d’ADNc, le tri d’ARNm ainsi que la construction de sondes d’ADN. L’une des difficultés de cette méthode concerne la préparation des ARN qui peuvent être très facilement dégradés et contaminés par de l’ADN génomique.
VII- Exemples d’application de la PCR :
Les applications de la PCR sont très nombreuses et la plupart des méthodes de biologie moléculaire reposent au départ sur la PCR
1/ Détection d’ OGM :
Pour rechercher la présence d’un transgène (par exemple le gène de résistance à un herbicide) chez un organisme, on peut utiliser des amorces de PCR (oligonucléotides synthétiques) spécifiques de la séquence de ce transgène. Si le transgène n’est pas présent dans l’organisme testé, les amorces ne s’hybrident pas sur l’ADN extrait de cet organisme et il n’y aura pas de produit d’amplification. Au contraire, si le transgène est présent, il sera détectable par l’obtention d’un produit d’amplification.
2/ Diagnostic moléculaire par recherche de la mutation delta F508 :
L’ADN du patient est extrait à partir d’un prélèvement de sang veineux ou de cellules trophoblastiques ou amniotiques dans le cas du diagnostic prénatal. La séquence du gène CFTR étant connue, il est possible de synthétiser deux amorces oligonucléotidiques de part et d’autre de la région de l’exon 10 ou se trouve potentiellement la mutation delta F508. Une réaction de PCR permet l’amplification de cette région, que celle-ci soit normale (absence de la mutation delta F508) ou mutée (présence de la mutation). La distinction entre les trois génotypes possibles (N/N, delta F/N ou delta F/delta F) peut être obtenue par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et visualisation des produits de PCR aux UV.
Voilà un moment que je suis l'activité d'une boite qui prétend révolutionner la PCR : http://ceciestuntest.over-blog.com/article-2368756.html
Thermal gradient annonce 30 cycles pour 80 pb en moins de 5 minutes http://www.thermalgradient.com/ mais ils commencent à se faire attendre : pas de nouvelles depuis 2 ans... j'espère, pour tous les thésards, que ce n'est qu'un retard!